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PCR擴增試劑盒在實(shí)驗時(shí)的幾點(diǎn)事項解析

更新時(shí)間:2021-07-08點(diǎn)擊次數:773
   PCR擴增試劑盒提供DNA高保真擴增所需要的基本試劑。DNA擴增時(shí),用戶(hù)需要自行準備模板和擴增所需要的引物。高溫嗜熱Pfu DNA聚合酶主要用于對保真度要求非常高的DNA擴增,這些擴增要求擴增的產(chǎn)物中不能出現突變等錯誤。Taq DNA聚合酶的擴增性能很強,但是用Taq擴增的PCR產(chǎn)物中有難以避免的隨機突變。Pfu DNA聚合酶除了5′-3′的聚合特性外,還有3′-5′端外切酶活性,具有校正DNA擴增過(guò)程中突變。Pfu DNA的長(cháng)片段擴增的能力不及Taq DNA聚合酶,用戶(hù)如果用于長(cháng)鏈PCR擴增,可選用Long Taq或者Taq Plus DNA聚合酶。
  PCR擴增試劑盒的實(shí)驗事項說(shuō)明:
  1.樣本上多重PCR平臺可以做的樣本包括血液、唾液、口腔拭子,在實(shí)驗中,對于DNA投入量要求不是很高,根據不同項目需求,DNA投入量的范圍在100 pg-100 ng之間。
  2.進(jìn)行PCR反應前可將所有g(shù)DNA的濃度稀釋到同一濃度,并轉移到PCR八聯(lián)管中,一方面是便于排槍操作,另一方面是加入相同起始量的gDNA,這樣可降低最終文庫的濃度差異,便于混合文庫。
  3.大多數情況下引物是一管,操作相當方便;當目標區域是外顯子或者是其他連續區域時(shí),我們會(huì )把引物分裝為二管,分別命名Primer pool T1與Primer pool T2,這時(shí)需要第二輪PCR前把產(chǎn)物合并,再進(jìn)行下一步反應。
  4.執行多重PCR反應時(shí),特別是樣本量多的情況下,可以將T1設為一組,T2設為一組,便于制備反應試劑混合液和排槍操作;并把解凍好的試劑放置在冰盒上,在冰盒上進(jìn)行加樣操作。
  5.實(shí)驗中可在PCR管壁上和管蓋上同時(shí)進(jìn)行反應編號標記,防止高溫或其他原因導致記號消失,避免后續產(chǎn)物混合操作失誤,造成樣本交叉污染。
  6.第二輪PCR后,因為B試劑比較粘稠,在清洗純化的時(shí)候不能吸走所有試劑,可以剩余5-10μl,否則會(huì )把磁珠一起吸走,造成樣品的損失,導致產(chǎn)物回收率下降。
  實(shí)驗完成后,正常文庫濃度處于5-30 ng/μl,而片段長(cháng)度一般在280-460 bp之間,且主峰前后無(wú)雜峰,就可以進(jìn)行測序了。

TEL:021-61210612

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